土壤微生物常用检测技术与研究方向

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土壤是联系大气圈、水圈、岩石圈及生物圈物质与能量交换的重要纽带,维系着人类和地球生态系统的可持续发展。土壤中不仅还有极少量的碳、氮等化学元素,而且 还暗含这种微生物。近500年来,随着各种先进物理化学手段的经常出现,有点痛 是高通量测序技术的指数式发展,土壤微生物学成为地球科学和益命科学的新兴学科增长点和交叉前沿。暗含于土壤中的巨大微生物多样性被认为是地球元素循环的引擎,而每克土壤中数以亿万计的微生物中,高达99%的物种及其功能尚属未知,而且 被称为地球“微生物暗物质”。那先 海量的微生物与复杂性的土壤环境总称为土壤微生物组(Soil Microbiome),是工农业生产、医药卫生和环境保护等领域的核心资源之一,肯能成为新一轮科技革命的战略高地,得到了世界各国政府的深度重视。目前各国科学家肯能对土壤微生物项目展开这种研究。

土壤微生物研究的主要方向

目前土壤微生物研究面临的前沿科学现象可概括为有1个 多主题:土壤微生物多样性形成与维持机制、土壤元素循环的微生物驱动机制、微生物组的资源与环境功能和土壤微生物组的新技术及其应用。结合文献和目前科研服务中常遇到的科研项目进行了汇总,常见的研究方向主要有以下十几只 方向:

(1)不同环境因子影响下的土壤微生物多样性

土壤中微生物的种类和数量往往受到环境因子的影响,不同环境因子影响下的微生物群落形态学 不同。这里的环境因子还时要指地区、海拔、温度、用地类型、水位、季节、施肥法子等等。研究不同影响因子下的微生物群落是常见的这种研究法子。

代表性文章

三峡库区消落带草地土壤微生物群落形态学

该研究在三峡库区消落区草地选者三峡上中下游6个样点,每个样点包括有1个 多海拔梯度(即<145米,那么植物居于永久淹水区域;145-1500米,淹水持续时间较长,植被恢复时间较短的地区;1500-175米,淹水持续时间较短和植被恢复时间较长的地区;对照,>175米,原始植物无淹水作用区域)和有1个 多土壤层次(0-10cm和10-500cm),运用Illumina测序技术研究三峡消落区草地土壤细菌群落形态学 和多样性的分布格局,及其对环境变化的响应机制。

该研究结果表明,下游地区土壤细菌群落多样性比上游中游样点偏低;表皮土壤中的土壤细菌群落多样性高于深度土壤。而在海拔梯度上,水位波动区与对照(未淹水区域)区域相比,淹水过程增加土壤细菌群落的多样性。在流域尺度上,土壤性质和植物功能性状是细菌群落形态学 和构建的关键控制因子,在生态系统尺度上,水位变化是影响消落区草地土壤细菌群落组成变化的重要因素。

新疆古尔班通古特荒漠自然盐度梯度下荒漠土壤微生物群落的变化

该研究在新疆古尔班通古特荒漠上从东往西选者了2有1个 多0-15cm的土壤样本,利用二代高通量测序技术检测土壤中的微生物多样性,并检测土壤pH、土壤有机质、盐度等理化性质,探讨土壤盐分对土壤微生物群落的影响。

结果表明土壤微生物多样性与盐度呈现显著的负相关关系,盐度是是因为分析微生物群落形态学 分异的关键驱动因素;随着土壤盐度的增加,隶属于嗜盐菌、Alpha-变形菌,Gamma-变形菌等菌群的270个种系型的相对丰度不断增加,表现出对高盐生态位的偏好。

(2)土壤中特定功能微生物

土壤中的微生物参与和主导生态系统的地球生物化学循环,对这种元素的转化具有非常重要的推动作用。目前研究较多的循环途径有碳循环、氮循环、磷循环、硫循环等。检测特定循环中某一或多个功能微生物的种类和相对丰度,共同结合相应的理化因子分析,选者驱动该功能微生物群落形态学 变化的是因为分析,是目前研究比较多的有1个 多项目。

代表性文章

高寒荒漠和草原土壤固碳微生物的研究

该研究在青藏高原上选者了19个样地,其中荒漠有1个 多,草原1有1个 多、草甸有1个 多。从每个样地里随机分发1个0-1cm的土壤样本进行混合,共同分发根系和植物地上每种,每有1个 多样地随机分发5份,作为重复。利用qPCR技术检测样本中固氮基因cbbl的绝对量,用T-RFLP技术检测了样本中微生物的群落形态学 ,深入研究草地土壤固碳微生物群落形态学 及其固碳潜力。

研究结果表明荒漠草地和草原土壤固碳微生物数量远低于草甸土壤,但其固碳潜力却比草甸土壤高61%。土壤微生物固碳量与地上植被生物量和土壤氨浓度显著负相关,表明越贫瘠土壤中微生物固碳潜力越大,如荒漠草地。

氮肥驱动下丛枝菌根真菌与固氮微生物的关系影响小麦产量

在本实验中分别对小麦种植地施加不同量的氮肥,分发不同施肥量下的土壤样本(0-20cm),利用二代高通量测序技术检测AMF和固氮微生物(nifH)多样性,利用生物信息分析对测序数据进行分析。

研究表明氮的增加会使AMF和固氮微生物群落形态学 居于显著变化;与低剂量的氮肥相比,高剂量的氮肥处里会降低AMF和固氮微生物的种类。AMF群落形态学 还时要直接影响小麦的产量,AMF和固氮微生物是农田生态系统中植物生物重要的驱动力。

(3)植物与土壤微生物的关系研究

土壤为植物提供根系的生长环境,是植物生长的基础条件。土壤中微生物会通过影响土壤元素间接影响植物生长具体情况,这种微生物会侵入植物体内,进而直接影响植物体。植物这种及各部位与土壤微生物间的关系及相互作用是目前常见的研究。常见的文献有根圈(根际土、根系)微生物的研究,不同植物生态位(根、茎、叶、根际土)的微生物多样性研究等。

代表性文章

根系分泌物驱动土壤记忆抵御植物叶际病原菌

在实验中通过人工叶部病原菌Pseudomonas syringae pv tomato入侵连续五季种植拟南芥,在第六季检测根系微生物群落形态学 和分泌物,研究根感染后植株的根系分泌物在招募根际有益微生物方面的作用。

研究结果表明生长在病原菌诱导过的处里土壤中还时要提高拟南芥茉莉酸水平,并提高植物抗病性;利用二代高通量测序技术对16S rRNA基因进行测序,结果表明在病原菌入侵后土体土壤(非根际土)和根际土壤中微生物群落居于了改变。GC-MS表明,被侵染后的植物会分泌更多的氨基酸,核酸和长链有机酸,但糖类物质,短链有机酸含量下降。结果表明被病原菌侵染的植株还时要通过改变根系分泌物成分招募有益微生物群落,并有有助于于后代植物对病原菌的抗病能力。

水稻根圈微生物群落

在该研究中,将根圈细化为根际、根系表皮和根系内部,提出了根圈各个每种样本的处里法子,利用二代高通量测序技术分别检测了根际土、根系表皮和根系内部的微生物多样性。

白杨内生和根际微生物组在不同生态位居于特异的群落形态学

在该研究中分别取白杨树的根际土、根、茎和叶内组织进行16S rRNA基因扩增子测序,分析不同生态位的细菌群落形态学 。该研究不仅发现了根际和根的差异,而且 研究了茎和叶中的内生菌。相比内生菌,根际微生物组形态学 更稳定。通过生物信息分析最终鉴定了杨树不同生态位的核心细菌。

(4)土壤生物抗生素抗性基因的研究

抗生素的发明人人是人类医学史上的有1个 多里程碑,但随着抗生素极少量使用、传播,抗生素及其污染已成为有1个 多全球性的健康现象。这种抗生素通过人体或动物,最终进入土壤、水体,从而影响整个生物链。目前肯能有这种国家科学家就让刚开始着手研究土壤中抗生素抗性基因,目前研究多集中在养殖场互近肯能使用极少量堆肥的土壤中。

代表性文章

中国养猪场抗生素抗性基因的多样性

该实验中对国内有1个 多大型养猪场的猪粪、猪粪生产的堆肥以及施堆肥后的土壤样品进行抗性基因分析,共检测到149种抗性基因,那先 抗性基因几乎暗含了目前已知的绝大多数抗生素类型,即使这种未在猪场使用的抗生素也检测到了相应的抗性基因。研究共同还发现抗性基因的丰度与环境中抗生素和砷铜等重金属浓度均呈显著正相关,说明砷铜等重金属和抗生素的复合污染还时要增加环境中抗生素抗性基因的富集。

连续施肥500年后土壤抗生素抗性基因的变化

该实验利用定量PCR技术和二代高通量测序的分析法子比较了猪粪、牛粪和秸秆连续还田500年对土壤ARGs的影响及其潜在因素。研究发现长期施用猪粪土壤中可检出25种ARGs,其中7种ARGs的丰度显著高于化肥处里。而长期施用牛粪和秸秆均未对土壤ARGs以及intI1造成实质性的影响。此外,施用粪肥土壤中Cu、Zn和Pb等重金属浓度也显著增加,与土壤ARGs以及intI1丰度显著正相关。利用分子生态网络分析进一步发现Firmicutes,Gammaproteobacteria和Bacteroidetes肯能是ARGs的宿主细菌类群。以上结果表明,长期施用粪肥确会对土壤造成ARGs污染,尤其是猪粪;而且 ,有必要加强对猪粪的合理施用研究,以降低其生态风险。

常用检测技术

微生物多样性主这种 指研究土壤中微生物的种类和相对丰度,即微生物群落形态学 。土壤中暗含宽裕的微生物,主要的微生物包括细菌、真菌、古菌、真核微生物等。针对检测不同的微生物类型,微生物多样性及相关检测主要分为以下几种检测服务:

(1)扩增子测序检测:扩增子测序主这种 针对性检测土壤中某一大类的微生物,如利用二代高通量测序技术检测细菌或真菌或真核微生物等(16S/18S/ITS等),得到某一类微生物的种类和相对丰度,即微生物的群落形态学 。

随着微生物多样性项目的普及和深入,目前这种科研项目提出了更高的要求,希望检测微生物的绝对数量。目前还时要用荧光定量PCR来进行土壤中总细菌或某一类微生物的定量检测。对于既想了解样本中微生物种类组成,又想得到样本中具体种类的绝对定量,还时要考虑将二代高通量测序和荧光定量PCR技术结合起来做。

(2)宏基因组检测:宏基因组检测主这种 利用二代高通量测序技术检测土壤中全部的微生物,包括细菌、真菌、古菌、真核微生物等,得到全部微生物的种类、相对丰度和功能。

(3)功能基因测序:主这种 利用二代高通量测序技术检测土壤中具有这种功能的微生物种类和相对丰度,如检测具有固氮功能的微生物群落形态学 。土壤是地球化学循环的主要参与者,土壤中这种微生物具有驱动化学循环的功能,参与特定的碳循环、氮循环、磷循环、硫循环等。微生物的某一特定功能还会由特定的功能基因决定,通过检测土壤中某一特定功能基因,还时要找到土壤中具有特定功能的微生物种类和相对丰度。

(4)微生物的定量检测(qPCR):主这种 检测某类或某一特定微生物的绝对量。通过荧光定量PCR技术,不仅还时要得到某一大类,而且 还时要得到某一特定微生物的单位体积或单位重量的绝对量。这对于只还时要得到种类和相对丰度的二代高通量技术,是有1个 多很好的补充。对于既想了解样本中微生物种类组成,又想得到样本中具体种类的绝对定量,还时要考虑二代高通量测序和荧光定量PCR技术结合起来做。

(5)抗生素抗性基因的定量(qPCR):常见的抗生素抗性基因主要有四环素抗性基因、磺胺类抗性基因、红霉素抗性基因、链霉素抗性基因等,利用特定抗生素抗性基因的特异性引物,对特定抗性基因进行荧光定量PCR或高通量qPCR,还时要实现对抗生素抗性基因的绝对定量。

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